Πώς κόβουμε DNA με περιοριστικές ενδονουκλεάσες, το ενώνουμε με φορέα κλωνοποίησης, το βάζουμε σε βακτήρια και φτιάχνουμε γονιδιωματικές και cDNA βιβλιοθήκες. Πώς βρίσκουμε τον κλώνο που θέλουμε με υβριδοποίηση και πώς πολλαπλασιάζουμε DNA με PCR.
Γ΄ ΛΥΚΕΙΟΥΒΙΟΛΟΓΙΑ, ΤΕΥΧΟΣ Β΄ΚΕΦ. 415 ΛΕΠΤΑ
Το μάθημα είναι στο σχολικό βιβλίο. Δεν το αντιγράφουμε εδώ. Άνοιξε το επίσημο
κεφάλαιο και γύρνα για την εξάσκηση.
Η σύνοψη, οι όροι και οι ασκήσεις γράφτηκαν με τη βοήθεια τεχνητής νοημοσύνης από το
σχολικό βιβλίο και μπορεί να έχουν λάθη. Πηγή είναι πάντα το βιβλίο: ό,τι σου φαίνεται περίεργο,
έλεγξέ το εκεί. Βρήκες λάθος; Γράψε μας στο aporia@signmak.com.
Σχεδιάγραμμα
Δική μας σύνοψη της ενότητας, για επανάληψη, γραμμένη με τη βοήθεια τεχνητής νοημοσύνης. Μπορεί να έχει λάθη: πηγή είναι πάντα το βιβλίο.
Τι έγινε
Η απομόνωση ενζύμων επέτρεψε να γίνονται in vitro αντιγραφή, αντίστροφη μεταγραφή, μεταγραφή και μετάφραση. Με τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες και τους φορείς ο άνθρωπος φτιάχνει ανασυνδυασμένο DNA, δηλαδή τεχνητό μόριο με γονίδια από δύο ή περισσότερους οργανισμούς, που περνά σε βακτήρια ή ευκαρυωτικά κύτταρα και κληρονομείται στους απογόνους τους. Οι τεχνικές επέμβασης στο γενετικό υλικό συνιστούν τη Γενετική Μηχανική, με στόχους την κατανόηση της ζωής και της εξέλιξης και τη βελτίωση της υγείας και της διαβίωσης.
Στάδια: (1) κατασκευή ανασυνδυασμένου DNA: το ολικό DNA του δότη κόβεται με περιοριστικές ενδονουκλεάσες και ενώνεται με φορέα κλωνοποίησης (πλασμίδιο ή DNA φάγου), μόριο που αυτοδιπλασιάζεται ανεξάρτητα στον ξενιστή· (2) εισαγωγή σε κύτταρο ξενιστή, που για βακτήριο λέγεται μετασχηματισμός· (3) επιλογή των ξενιστών που πήραν το ανασυνδυασμένο DNA· (4) εντοπισμός του κλώνου με το επιθυμητό τμήμα με ανιχνευτές. Κλώνος: ομάδα πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών· κλωνοποίηση: παραγωγή πολλών τέτοιων.
Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες παράγονται από βακτήρια, όπου τα προφυλάσσουν από ξένο DNA, και αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 νουκλεοτιδίων σε δίκλωνο DNA. Η EcoRI (από την Escherichia coli) αναγνωρίζει το 5΄-GAATTC-3΄ και κόβει κάθε αλυσίδα ανάμεσα σε G και A, αφήνοντας μονόκλωνα άκρα που ζευγαρώνουν με τα συμπληρωματικά άκρα κάθε κομματιού κομμένου από το ίδιο ένζυμο. Επειδή η αλληλουχία είναι διάσπαρτη, ένα ευκαρυωτικό γονιδίωμα κόβεται σε χιλιάδες κομμάτια.
Το πλασμίδιο που χρησιμεύει ως φορέας έχει την αλληλουχία αναγνώρισης μία μόνο φορά, οπότε η EcoRI το ανοίγει σε γραμμικό μόριο με μονόκλωνα άκρα. Αναμειγνύεται με τα κομμάτια του δότη και η DNA δεσμάση, ένζυμο της αντιγραφής, τα συνδέει· ορισμένα πλασμίδια ξανακλείνουν χωρίς ξένο DNA. Με κατάλληλη κατεργασία το τοίχωμα του βακτηρίου γίνεται για λίγο διαπερατό και το πλασμίδιο μπαίνει μέσα (μετασχηματισμός), σε μικρό ποσοστό των κυττάρων.
Επιλέγονται τα βακτήρια που αναπτύσσονται παρουσία αντιβιοτικού, αφού το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο φέρει γονίδιο ανθεκτικότητας. Κάθε βακτήριο με ένα ανασυνδυασμένο μόριο δίνει μια αποικία, έναν κλώνο· το σύνολο των κλώνων που καλύπτει όλο το DNA του δότη είναι η γονιδιωματική βιβλιοθήκη. Τα πλασμίδια είναι ο συνηθέστερος φορέας για μικρά γονιδιώματα, ενώ ο βακτηριοφάγος λ δέχεται μεγαλύτερα κομμάτια με την ίδια στρατηγική.
Η cDNA βιβλιοθήκη κλωνοποιεί μόνο όσα γονίδια εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα (π.χ. γονίδια αιμοσφαιρίνης στα πρόδρομα ερυθροκύτταρα). Απομονώνεται το ώριμο mRNA, η αντίστροφη μεταγραφάση φτιάχνει συμπληρωματικό cDNA και προκύπτουν υβρίδια cDNA-mRNA· το mRNA διασπάται χημικά ή αποδιατάσσεται με θέρμανση, το cDNA γίνεται καλούπι για δεύτερη αλυσίδα και το δίκλωνο DNA μπαίνει σε πλασμίδιο ή φάγο. Περιέχει μόνο εξώνια και επιτρέπει στον ξενιστή να συνθέσει την πρωτεΐνη του γονιδίου.
Αποδιάταξη: με θέρμανση ή χημικές ουσίες σπάνε οι δεσμοί υδρογόνου και οι δύο αλυσίδες χωρίζουν· υπό κατάλληλες συνθήκες ξαναζευγαρώνουν. Υβριδοποίηση είναι η σύνδεση συμπληρωματικών μονόκλωνων αλυσίδων DNA-DNA ή DNA-RNA. Στη βιβλιοθήκη (ολόκληρα γονίδια, κομμάτια γονιδίων, μη κωδικές περιοχές) ο κλώνος εντοπίζεται με ιχνηθετημένους ανιχνευτές DNA ή RNA, που υβριδοποιούν μόνο το συμπληρωματικό τους αποδιαταγμένο DNA· το ίδιο γίνεται και σε cDNA βιβλιοθήκη.
Πολλά αντίγραφα ενός γονιδίου χρειάζονται για τη μελέτη του και για την παραγωγή της πρωτεΐνης του. Η PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) αντιγράφει επιλεκτικά, εκατομμύρια φορές, μια ορισμένη αλληλουχία μέσα από μείγμα DNA, σε δοκιμαστικό σωλήνα χωρίς ζωντανά κύτταρα. Εφαρμόζεται ευρέως από το 1985 και χρησιμοποιείται στη διάγνωση ασθενειών όπως το AIDS, στην εγκληματολογία και στη μελέτη DNA από απολιθώματα.
Γιατί το DNA του δότη και το πλασμίδιο κόβονται με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση;
Έτσι αποκτούν συμπληρωματικά μονόκλωνα άκρα, που ζευγαρώνουν με δεσμούς υδρογόνου. Στη συνέχεια η DNA δεσμάση ενώνει οριστικά τα δύο κομμάτια και προκύπτει ανασυνδυασμένο πλασμίδιο.
Σε τι διαφέρει μια cDNA βιβλιοθήκη από μια γονιδιωματική;
Η γονιδιωματική βιβλιοθήκη περιέχει σε κλώνους όλο το DNA ενός οργανισμού, μαζί με τμήματα που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Η cDNA βιβλιοθήκη φτιάχνεται από το ώριμο mRNA συγκεκριμένων κυττάρων, άρα περιέχει μόνο τα γονίδια που εκφράζονται εκεί και μόνο τα εξώνιά τους.
Πώς επιλέγονται τα βακτήρια που πήραν ανασυνδυασμένο πλασμίδιο;
Ως ξενιστές χρησιμοποιούνται βακτήρια χωρίς πλασμίδια, ευαίσθητα σε αντιβιοτικά. Το πλασμίδιο φέρει γονίδιο ανθεκτικότητας, οπότε σε θρεπτικό μέσο με το αντιβιοτικό αναπτύσσονται μόνο όσα το έχουν προσλάβει.
Ανοίγει το μενού κοινοποίησης του κινητού σου. Αν δεν υπάρχει, αντιγράφεται ο σύνδεσμος.
Νέα από το aporia.gr Νέες ενότητες και ό,τι βρίσκουμε στα θέματα των Πανελληνίων, στη σελίδα μας στο Facebook.